Séquencer une molécule d’ADN unique en l’étirant

Séquencer une molécule d’ADN unique en l’étirant

Les méthodes habituelles de séquençage d’ADN reposent sur la réplication en grand nombre de la séquence que l’on veut décrypter, utilisant des nucléotides fluorescents qui ont l’inconvénient d’être chers et source d’erreur. Une collaboration de physiciens du Laboratoire de physique statistique de l’ENS (CNRS / ENS Paris / UPMC / Univ. Paris 7) et de l’Université de Penn State vient de prouver expérimentalement la faisabilité d’une nouvelle technique reposant sur des mesures mécaniques appliquées à une molécule unique, c’est à dire sans réplication et sans nucléotide fluorescent. Ce travail fait l’objet d’une publication dans la revue Nature Methods.

Dans une première étape, le fragment d’ADN à étudier est sous la forme d’un simple brin et prend la forme d’une épingle. Les physiciens attachent une extrémité du brin à un substrat et l’autre extrémité à une bille magnétique. En tirant sur cette bille, il est possible d’ouvrir la molécule, comme une fermeture éclair. Si l’on relâche la tension, la molécule se referme sur elle-même, à moins que de courtes séquences d’ADN aient été placées dans la solution qui baigne le fragment et viennent s’hybrider avec les séquences complémentaires du brin d’ADN, bloquant alors de façon transitoire la fermeture de la molécule. En mesurant l’extension de la molécule lors de ces blocages, il est possible de déterminer la position de ces hybridations. Cette approche peut être utilisée pour identifier un fragment d’ADN avec une séquence connue au sein d’un mélange de différents fragments et pour séquencer une molécule d’ADN soit par hybridation soit par ligation.

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Schéma de principe de la méthode
a) une molécule d’ADN (en bleu) est assemblée en une épingle à cheveux en lui associant une boucle à une extrémité et une fourche à l’autre extrémité. Les bras de cette fourche permettent de l’attacher à une bille magnétique et à la surface de l’échantillon. b) En approchant des aimants de la bille, on exerce une force qui lorsqu’elle excède 15pN, dégrafe l’ADN, ouvrant complètement l’épingle à cheveux. Dans cet état ouvert, l’extension de la molécule est maximale et des oligo-nucléotides (marron, violet et rose) peuvent s’hybrider à l’ADN ouvert. En écartant les aimants, on relâche la force et l’épingle se referme comme une fermeture éclair conduisant à une diminution rapide de l’extension. Mais les oligo-nucléotides hybridés bloquent la fermeture de la molécule de façon transitoire provoquant les pauses (iii, iv, v) avant que la molécule ne se referme complètement (vi). La position de ces blocages permet de localiser les séquences complémentaires aux oligo-nucléotides.

Single-molecule mechanical identification and sequencing, Fangyuan Ding1,2, Maria Manosas1,3, Michelle M Spiering4, Stephen J Benkovic4, David Bensimon1,2,5,Jean-François Allemand1,2 & Vincent Croquette1,2, Nature Methods 9, 367–372 (2012)

Contact chercheur

Vincent Croquette, chercheur

Informations complémentaires

1Laboratoire de physique statistique de l’ENS :

2Institut de Biologie de l′Ecole Normale Supérieure, Paris

3Departament de Física Fonamental, Facultat de Física, Universitat de Barcelona, Spain

4Department of Chemistry, The Pennsylvania State University, University Park, Pennsylvania, USA

5Department of Chemistry and Biochemistry, University of California Los Angeles, California, USA

Contacts INP

Jean-Michel Courty,
Catherine Dematteis,
Karine Penalba,
inp-communication cnrs-dir.fr